飼料微​​生物製剤中の枯草菌の試験

ICS 65.120                                                                                                                  Classification番号：B 46

GB / T 26428-2010

P中華人民共和国国家基準

飼料中の枯草菌の試験基準

発行日：2011-01-14                                                                                  

実装：2011-07-01 

が発行：P中華人民共和国国家標準化管理委員会品質監督・検査・検疫総局

序文

この規格は、GB /T1.1-2009の規制に従って作成されています。

この規格は、全国飼料産業標準化技術委員会（SAC / TC 76）の管轄下にあります。

この基準は、広東省の微生物分析および試験センターによって提案および起草されました。

この規格の主な製図者は、Honghui Zhu、Xiaotang Sun、Songzhen Yang、Yuanliang Chen、XianjiaoZhangです。

飼料微​​生物製剤中の枯草菌の試験

1.1。 適用範囲

この基準は、飼料微生物製剤中の枯草菌の試験に関する規制を定義しています。

この基準は、飼料微生物製剤中の枯草菌の試験と計算に適用できます。

2.2。 規範的参照

この文書の適用には、以下の文書が不可欠です。日付付きの参照の場合、日付付きのバージョンのみがこのドキュメントに適用されます。日付のない引用文書の場合、最新バージョン（すべての修正を含む）がこの文書に適用されます。

GB / T 8170数値の丸め規則、および制限値の表現と判断

GB / T 14699.1フィードサンプリング（GB / T 14699.1 – 2005、ISO 6497：2002、IDT）

GB / T 20195動物飼料：サンプル準備（GB / T 20195 – 2006、ISO 6498：1998、IDT）

3.3。 希釈剤、媒体、および試薬

特に明記されていない限り、分析には分析的に純粋な試薬と蒸留水または脱イオン水または同等に純粋な水のみを使用します。

3.1。  0.85％滅菌生理食塩水

3.2。  栄養寒天（NA）培地、付録AのA.1を参照

3.3。  グラム染色液、付録AのA.2を参照

3.4。  7％塩化ナトリウム増殖培地、付録AのA.3を参照

3.5。  培地および試薬のVPテスト。付録AのA.4を参照してください。

3.6。  硝酸還元媒体および試薬。付録AのA.5を参照してください。

3.7。  D-マンニトール発酵培地、付録AのA.6を参照

3.8。  プロピオン酸利用媒体。付録AのA.7を参照してください。

4.4。 機器およびガラス製品

微生物学で一般的に使用される実験装置に加えて、他の装置およびガラス器具は次のようにリストされています。

4.1。  サーモスタットインキュベーター：37ºC±1ºC

4.2。  pHメーター、±0.1単位まで正確

4.3。  ガラスまたはプラスチックのペトリ皿

4.4。  マーキング容量が1mlおよび10mlで、最小スケールがそれぞれ0.1mlおよび0.5mlのスケーリングされたピペット

4.5。  ガラスまたはプラスチックでコーティングされたロッド

4.6。  1000倍ズームの顕微鏡

5.5。 サンプリング

テストサンプルは実際の代表的なものです。シャベル、スプーンサンプラー、試験管、ジャー、はさみなどのサンプリングツールは滅菌する必要があります。

サンプルは、できるだけ早く微生物検査室に送る必要があります。サンプリングのサイズと方法は、GB /T14699.1に従って実装する必要があります。

6.サンプル準備

サンプル準備はGB/T 20195に従って実施する必要があり、サンプルは準備後できるだけ早く検査する必要があります。

7.操作手順

7.1。検査と初期懸濁液および10倍希釈のためのサンプル準備。

無菌操作と条件を使用して、25 g（ml）のサンプルを量り、225 mlの0.85％滅菌生理食塩水を加え、1〜2分間ホモジナイズし、1：10の初期懸濁液を作成します。次に、1：10の初期懸濁液1 mlを吸引し、0.85％滅菌生理食塩水9 mlを加え、完全に混合して1：100に希釈します。サンプルの細菌含有量に応じて、さらに10倍段階的に段階的に希釈します。

7.2。  接種と文化

2〜3の適切な希釈液を選択し、80ºC±1ºCのウォーターバスで10分間維持および維持し、滅菌ピペットで0.1 mlを吸引し、2枚の栄養寒天プレートに接種します（3.2）。コーティングロッドを使用して、接種材料を寒天表面にできるだけ注意深く迅速に塗布します。コーティングロッドはペトリ皿の端に触れてはいけません。各皿に滅菌コーティングロッドを使用してください。コーティングされたペトリ皿に蓋をして、接種物が寒天に完全に吸収されるように、室温で15分間放置します。プレートを裏返し、37ºC±1ºCのインキュベーターに48±2時間置きます。

7.3。コロニーのカウントとスクリーニング

インキュベーション後、コロニー数が30〜300のプレートを選択します。大きなフレーク状のコロニーが皿の中で成長する場合、それは使用が宣言されていません。ただし、フレーク状のコロニーが皿の半分未満であり、残りの半分のコロニーの分布が非常に均一である場合、皿のコロニー数の半分を計算し、結果に2を掛けて、皿の総コロニー数。典型的な枯草菌のコロニーは、粗く、不透明で、光沢がなく、縁が拡張し、丸いまたは波状で、不規則な形をしており、外観は灰色がかった白または黄色がかっています。最後に、実験の確認のために、これらの特性を特徴とする5つのコロニーを選択します。

7.4。確認テスト

7.4.1。 概要

現在、市販の生化学的識別キットまたは生化学的識別チューブで使用される培地がこの規格の確認試験で使用される培地と同じである場合、これらのキットまたはチューブは、この確認を実行するための商品の指示に従って使用することができます実験。

7.4.2。 菌株の準備

ペトリ皿からコロニーを1つ選び、培養物を栄養寒天プレートにストリークし、37ºC±1ºCで48±2時間培養します。少なくとも1つの十分に分離された特徴的なコロニーを各皿から取り出し、ストリークして寒天皿に移し、確認テストのために保管する必要があります。

7.4.3。 形態学的観察

選択された精製コロニーは、グラム染色顕微鏡（3.3）を介して検査されました。枯草菌の細胞は棒状で、胞子は中生代または中生代に近い楕円形である必要があり、嚢胞は大幅に拡大してはなりません。

7.4.4。 物理化学的確認試験

精製されたコロニーは、7％塩化ナトリウム成長（3.4）、VPテスト（3.5）、硝酸還元（3.6）、D-マンニトール発酵（3.7）、およびプロピオン酸利用（3.8）のテストのために選択されました。

7.4.5。結果の確認

結果の確認は以下のとおりです。

1.1。 枯草菌のコロニーは表面が粗く、不透明で、灰色がかった白色または黄色がかった外観で、中生代または中生代に近い楕円形の胞子で棒状になっており、嚢胞は大きく拡大していません。

2.2。 テスト結果は、7％の塩化ナトリウムの成長、VPテスト、および硝酸塩の還元に対して陽性です。

3.3。 酸はD-マンニトール発酵によって生成することができます。

4.4。 プロピオン酸を使用せずに枯草菌と判断・判定できます。

枯草菌とバチルス様細菌の特徴を以下の表1に示します。

表1.枯草菌とバチルス様細菌の特徴

8.8。 結果とレポートの計算

8.1。  各皿の枯草菌コロニーの数を計算します。

枯草菌コロニーの数を計算します（a）フォーミュラ1を使用して各皿に。

式1

a =（b ÷ A）x C

伝説：

a：各皿の枯草菌コロニーの数。

b：サンプル選択後に枯草菌コロニーとして確認されたコロニーの数。

A：確認のために選択されたコロニーの数（5）;

C：の際立った特徴を具体化する皿の上のコロニーの数 枯草菌

最終結果（a）GB / T 8170の数値の丸め規則に従って、最も近い整数に丸める必要があります。

例えば：

枯草菌の特徴を特徴とする合計78のコロニーが皿にある場合、確認テストのために5つが選択され、そのうち4つが枯草菌のコロニーであることが確認されます。

a=（4/5）x 78 = 62.4

a= 62.4〜62

GB / T 8170の数値丸め規則によると、枯草菌コロニーの数（a）この料理は62です。

8.2。  サンプル中の枯草菌コロニーの数：計算方法とレポート

2つの段階希釈皿を選択し（各希釈には少なくとも1つの皿があり、皿に枯草菌の数が30〜300であることが確認されています）、式2を使用して計算します。これはサンプル中の枯草菌1mlまたは1gです。 、N。

フォーミュラ2

N=Ʃa / V（n₁ + 0.1n₂）・d

伝説：

N：サンプル中の枯草菌の総数。

Ʃa：すべての皿で確認された枯草菌の合計。

の：皿の接種量、ml;

n₁：最初の希釈のための皿の数;

n₂：2回目の希釈用の皿の数。

d：最初の希釈の希釈係数（の値d希釈されていないサンプルの場合は1）です。

最終結果（N）は、GB / T 8170の数値丸め規則に従って、有効数字2桁に丸める必要があります。サンプル内のBacillus Subtilisコロニーの数は、科学的記数法（1.0 – 9.9 x 10）を使用して記録することもできます。^バツ）。

サンプルのmlまたはgあたりの枯草菌の推定数、CFU/gまたはCFU/mlを報告します。

例1：

最初の希釈後の場合（10^-3）、枯草菌のコロニーの確認された数は、それぞれ168と215であり、2回目の希釈後（10^-4）、枯草菌コロニーの確認された数はそれぞれ34と35であり、次のようになります。

N =（168 + 215 + 34 + 35）/ [0.1 x（2 + 0.1・2）x 10^-3]

N = 472 / 0.00022

N = 2145450〜2100000

GB / T 8170の数値丸め規則によると、この例のサンプルの枯草菌の推定数は、gまたはmlの単位で、2100000 CFU / g（またはml）、つまり2.1x10です。⁶ CFU / g（またはml）。

例2：

最後の希釈の場合（10^-4）枯草菌のコロニー数がそれぞれ120と130であることを確認し、次のようにします。

N =（120 + 130）/（0.1 x 2 x 10^-4）。

N = 250 / 0.00002

N = 12500000〜12000000

GB / T 8170の数値丸め規則によると、この例のサンプルの枯草菌の推定数は、gまたはmlの単位で、12000000 CFU / g（またはml）、つまり1.2x10です。⁷ CFU / g（またはml）。